Lumafluor綠色RetroBeads操作使用注意事項

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RetroBeads™逆向示蹤熒光微粒是Lumafluor 公司特色的逆向示蹤產(chǎn)品，且是目前文獻證實有效的示蹤微粒（該產(chǎn)品的有效性經(jīng)數(shù)百篇從無脊椎動物到哺乳動物實驗的研究論文證實），  該示蹤產(chǎn)品體內(nèi)注射高度集中不易擴散，信號強，對活細胞或活體無毒，且存留時間大于一年，與大多順向示蹤劑、原位雜交檢測技術(shù)、免疫組化技術(shù)兼容。

Lumafluor 綠色 Green RetroBeads操作說明

一、包裝與稀釋：

  Lumafluor 的beads包裝于一支密封的小管內(nèi)，內(nèi)含的濃縮beads懸浮于蒸餾水中。如使用紅色Beads作為神經(jīng)通路的逆向示蹤，其稀釋方法推薦采用：大鼠視皮層內(nèi)可采用1：4比例進行稀釋而不減少Beads的熒光標(biāo)記強度和質(zhì)量。然而對于實驗我們不推薦使用稀釋的Beads而使用原液進行注射示蹤。除蒸餾水外，常規(guī)的鹽溶液如NaCl、KCl溶液也可作為稀釋液。如使用綠色Beads，則強烈建議使用原液，無需稀釋。

二、溫度儲存:

   為避免蒸發(fā)，Bead溶液應(yīng)存放于冰箱內(nèi)4度冷藏，切忌勿冷凍！ 冷凍的Beads將失去效用，無法使用。而變干的beads同樣也無法使用（無法重懸），該產(chǎn)品建議一年內(nèi)用完。

三、注射：

   Beads使用壓力注射，如1 mlHamilton微量注射器或氣壓注射系統(tǒng)，如需小區(qū)域微量注射(30-50 nl)，可采用末端30-50 um直徑的玻璃電極注射，而常規(guī)的逆向示蹤（注射量0.1-0.3 ul）可使用更大直徑的玻璃電極。盡管如此，即使注入更大的劑量，Beads，也不會明顯從注射位點擴散（通常擴散距離少于1mm），因此，為盡量充分標(biāo)記投射到一個較大神經(jīng)核團的神經(jīng)元，需使用多點注射。盡管Beads帶有負電荷，但是不建議采用離子滲透法注入示蹤Beads。

四、存活時間：

   在大多數(shù)恒溫脊椎動物系統(tǒng)中，檢測Beads的時間推薦為1周。目前并未檢測Beads的zui長可檢測期，然而在Beads的熒光強度和質(zhì)量至少可保持在體內(nèi)14個月以上不變，而細胞可能會被yongjiu標(biāo)記。目前并未發(fā)現(xiàn)Beads在動物或神經(jīng)元中表現(xiàn)出毒性作用的報道。

五、固定和處理：

   準(zhǔn)的固定方法是：0.1 M PBS沖洗或灌注后在4%的多聚甲醛（0.1 M PBS配制，pH 7.4）中固定，用戊二醛固定會產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光，妨礙Beads標(biāo)記的神經(jīng)元，并且綠色Beads在戊二醛固定的組織中將根本觀察不到，因此應(yīng)盡量避免采用。如采用冰凍切片，切片應(yīng)用PBS漂洗后用明膠包被的載玻片貼片晾干，在充分風(fēng)干后，再用二甲苯透明1分鐘，然后用熒光封片劑（Fluoromount或Krystalon）封片。Fluoromount可從Atomergic Chemetals Corp., （Farmingdale, NY）公司購買; Krystalon可從Harleco (EM Industries，Gibbstown, NJ）購買（靶點科技有售）。切片只可短期暴露在乙醇或二甲苯中，但是長時間暴露（大于5分鐘）會損壞Beads。Beads 對甘油非常敏感，在甘油環(huán)境中熒光會迅速萃滅，因此切忌使用甘油類封片劑，如無法避免，還可采用水楊酸甲酯代替甘油作為封片劑。封片后的切片如存放于黑暗環(huán)境中，熒光Beads標(biāo)記的細胞可保持一年不萃滅（但是切片的自身熒光背景會增加）。迄今為止，還沒有成功采用塑膠材料包被Beads標(biāo)記的組織的記錄。

六、成像觀察:

   紅色Beads中的染料為羅丹明，因此所有與羅丹明匹配的熒光濾鏡均可使用，部分老的尼康公司的羅丹明濾鏡因背景較高，可能導(dǎo)致無法觀察到熒光Beads，通常Zeiss 和Leitz的標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾鏡可獲得較好的觀察效果。而大多綠色熒光濾鏡均可較好地觀察綠色Beads的熒光結(jié)果，設(shè)置為熒光黃的濾鏡可獲得較強的明亮熒光，但是同時也帶來較高的背景干擾。較寬波段的熒光濾鏡比窄波段的熒光濾鏡可以獲得更強的熒光信號。在長時間的觀察和拍照下Beads的熒光也不會淬滅。

 在低倍數(shù)或低數(shù)值孔徑物鏡下(如 X4, X10)通常難以觀察到Bads的熒光信號，只有細胞被顯著標(biāo)記，X10的油鏡（數(shù)值孔徑大于0.4）或者更大倍數(shù)的物鏡才可觀察到。通常情況下，X 25的油鏡可以清晰地觀察到低倍鏡下無法觀察到的標(biāo)記細胞。物鏡的選用對綠色熒光Beads尤其重要。在做出實驗失敗的決定前（在目標(biāo)區(qū)域無法觀察到標(biāo)記細胞），可先用油鏡仔細觀察注射位點附近的細胞是否被標(biāo)記，此處應(yīng)該觀察到大量的標(biāo)記細胞。

  對使用綠色熒光Beads標(biāo)記的額外提醒：目前已發(fā)現(xiàn)綠色熒光Beads在年青動物比年老動物中標(biāo)記更為理想的情況，此外，年青動物的組織自發(fā)熒光（背景）也更低，因此，假如可以的話，在使用綠色熒光Beads做逆向標(biāo)記實驗時請盡量使用年輕動物。

  因為綠色熒光Beads的激發(fā)光段比紅色熒光Beads短，因此組織自發(fā)熒光是個問題，因此，應(yīng)采用減少自發(fā)熒光的步驟以獲得更理想的實驗結(jié)果，這些方法有：（1）使用更薄的切片，如30微米比40或50微米理想；（2）使用年青的動物；（3）封片后立即觀察拍照（隨著時間增加背景也會增加）。

七、參考文獻（詳詢靶點科技）:

1.Katz, L.C., Burkhalter, A., and Dreyer, W.D. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature 310: 498-500 (1984).

2.Katz, L.C. and Iarovici, D.M. Green fluorescent latex microspheres: a new retrograde tracer. Neuroscience 34: 511-520 (1990).